学术文章丨新羿数字PCR平台助力热带念珠菌唑类耐药快速检测

发布日期：2026-07-03

近日，北京协和医院检验科肖盟团队联合清华大学医学院郭永团队、北京朝阳医院感染与临床微生物科范欣团队在学术期刊International Journal of Antimicrobial Agents上发表了题为“Droplet digital PCR assay for simultaneous detection of the ERG11 mutation and copy number variation associated with azole resistance in Candida tropicalis”的研究论文。

该研究建立了一种基于微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的热带念珠菌唑类耐药检测方法，可在同一检测体系中同时识别ERG11 A395T/W（Y132F）突变和ERG11基因拷贝数变异（CNV），为临床耐药预测和耐药机制监测提供了一个快速、定量、可扩展的技术工具。

为什么关注热带念珠菌唑类耐药？

热带念珠菌（Candida tropicalis）是侵袭性念珠菌感染的重要病原体之一。近年来，热带念珠菌对氟康唑等唑类药物的耐药率在我国及亚太地区持续上升，部分医院耐药率已超过30%，给临床抗真菌治疗带来严峻挑战。前期基因组研究显示，临床耐药热带念珠菌常集中于特定耐药克隆群，并具有相对明确的分子特征：携带唑类药物靶基因ERG11 A395T/W点突变的同时常伴随等位基因的拷贝数扩增，在降低与药物亲和力的同时通过基因剂量效应进一步增强耐药水平。换句话说，热带念珠菌对唑类耐药并不只是“有没有突变”的问题，还涉及“突变基因有多少个拷贝”。这也正是本研究选择ddPCR技术的关键原因。

ddPCR的价值：不只是检测突变，更是定量“数拷贝”

全基因组测序（WGS）能够同时分析点突变、拷贝数变异及克隆传播背景。然而，WGS在常规临床应用中仍面临成本、周转时间、数据分析复杂度等限制。实时荧光PCR可以用于检测特定位点突变，但对于热带念珠菌ERG11这类存在等位基因扩增的耐药机制而言，仅判断“突变阳性/阴性”并不足够。更关键的问题是：野生型ERG11有几个拷贝？突变型ERG11又有几个拷贝？ddPCR的优势正在于此。该技术将样本分配到大量微滴反应单元中，通过终点荧光信号和泊松分布计算，实现无需标准曲线的核酸绝对定量。本研究利用ddPCR同时区分ERG11野生型与A395T/W突变型等位基因，并进一步计算其拷贝数状态。

数字PCR工作流程

本研究建立的ddPCR检测流程包括核酸提取、ddPCR反应体系构建、微滴生成、PCR扩增、微滴读取和数据分析。整个流程可在约4小时内完成，并支持批量样本检测。

研究结果一：重复性好，高拷贝样本也能稳定定量

研究首先评估了ddPCR方法的重复性。结果显示，各分离株的ERG11突变状态判定在所有重复实验中均完全一致。在具有不同ERG11拷贝数的代表性分离株中，ERG11野生型与突变型拷贝数的定量结果表现出高度一致性。即使在ERG11拷贝数显著升高的菌株中（CN>10），重复测量之间的变异仍然很小，并未因拷贝数升高而出现明显方差增加，表明该检测方法在广泛的动态范围内保持了精密度。

研究结果二：突变检测灵敏度和特异度均为100%，拷贝数精准定量

在93株临床分离株的方法学验证中，ddPCR检测ERG11 A395T/W突变的灵敏度与特异性均达到100%，与WGS结果完全一致，包括正确识别所有纯合突变和杂合突变。在拷贝数定量方面，ddPCR与WGS之间显示出极强的线性相关性（R²=0.98，斜率=1.00），总体平均偏差仅为+0.09±0.25个拷贝，证实了该方法在定量精度方面的卓越表现。更重要的是，ddPCR可以直接获得野生型和突变型ERG11等位基因的拷贝数信息，为研究“突变等位基因特异性扩增”提供了比单纯总拷贝数更精细的检测维度。

研究结果三：可用于预测氟康唑耐药性

在四家医院收集的98株引起侵袭性感染的热带念珠菌中，ddPCR正确预测了35株体外药敏检测耐药株中的32株，并正确判定全部63株敏感分离株为“敏感”。对应的灵敏度为91.4%，特异度为100%，总体分类一致性为96.9%。对于未被ddPCR判定为耐药的3株耐药分离株，后续基因组回顾分析显示，其中2株携带了当前ddPCR检测组合尚未覆盖的其他ERG11突变，例如F145L、Y257H；另1株未发现可识别的ERG11突变或拷贝数变异。

研究结果四：临床标本直接检测的探索性验证

除培养分离株外，研究还探索了ddPCR在直接临床标本检测中的应用可能。作为概念性验证研究团队对一例腹腔内感染后继发脓毒性休克患者的腹水样本进行了ddPCR检测。临床常规使用MALDI-TOF MS系统对样本培养物进行菌种鉴定显示热带念珠菌和屎肠球菌，所分离热带念珠菌的药敏显示其对氟康唑（MIC>256mg/L）和伏立康唑（MIC>8mg/L）耐药。ddPCR直接检测腹水样本发现，该样本存在ERG11 A395W杂合突变，并定量显示野生型ERG11为1个拷贝，突变型ERG11为5个拷贝。该结果与相应培养分离株的ddPCR结果一致，也与其唑类耐药表型相符合。这一探索性结果提示，ddPCR未来不仅可用于培养后分离株检测，也可能进一步发展为直接临床样本中耐药机制快速识别的技术工具。

小结：从“检测耐药”走向“定量解析耐药”

本研究建立了一种基于ddPCR的热带念珠菌唑类耐药检测方法，可同时检测ERG11 A395T/W（Y132F）突变和ERG11拷贝数变异。与传统表型药敏试验相比，该方法检测周期更短，整个流程约4小时内即可完成，并可支持多达96个样本的批量检测。与WGS相比，该方法操作流程更简化，数据分析门槛更低，更适合在临床微生物实验室和耐药监测场景中推广应用。更重要的是，该方法并不只是回答“是否存在耐药相关突变”，而是进一步实现了对野生型和突变型ERG11等位基因拷贝数的绝对定量。这一特点使其能够帮助研究者和临床实验室更深入地理解热带念珠菌在抗真菌药物选择压力下的耐药进化过程。面对热带念珠菌唑类耐药率持续上升的趋势，ddPCR作为快速、准确、可定量的分子检测工具将成为耐药监测和精准抗真菌治疗的重要支撑。

肖盟和郭永为该研究的共同通讯作者，范欣、王楠为该研究的共同第一作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2026.107847

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