学术文章丨新羿数字PCR助力呼吸道病原体快速定量检测与动态监测

发布日期：2026-11-06

  近日，北京清华长庚医院联合清华大学的研究成果发表于英国皇家化学会旗下学术期刊《Analyst》，论文题为 “Multiplex digital PCR for rapid quantitative detection and dynamic monitoring of respiratory pathogens in bronchoalveolar lavage fluid”。该论文被遴选为期刊封面文章，并在 LinkedIn平台同步推送，获得国际学术圈关注。

  该研究构建了一种覆盖33种病原体的数字PCR（digital PCR，dPCR）检测方案，可在支气管肺泡灌洗液（BALF）中实现细菌、病毒、真菌及非典型病原体的绝对定量。研究同时系统比较了不同BALF前处理方法，并在105份临床样本中验证了检测性能。从样本前处理到结果输出的完整流程可在约2.5小时内完成，为下呼吸道感染的快速病原学检测及病原体载量动态监测提供了新的技术路径。

为什么关注下呼吸道感染的快速、定量检测？

  下呼吸道感染是全球重要的感染性疾病负担之一。对于重症及免疫功能低下患者，能否快速、全面地明确病原体，直接影响抗感染治疗方案的制定与调整。然而，现有检测方法各有局限：

  传统培养通常需要3～7天，对苛养菌及部分已接受抗菌药物治疗患者的样本，检测敏感性有限；宏基因组二代测序（mNGS）具有广谱、无偏倚检测的优势，但在常规临床应用中仍面临成本、数据分析复杂度及周转时间等限制；部分症候群多重PCR产品虽然能够快速筛查，却主要提供定性或半定量结果。

  因此，临床不仅需要知道“有没有病原体”，还希望进一步了解“病原体有多少”“是否同时存在多种病原体”，以及“治疗过程中病原体载量如何变化”。

dPCR的价值：不仅检出病原体，更能绝对定量

  数字PCR无需依赖标准曲线即可实现核酸绝对定量，并具有高灵敏度和较强的PCR抑制物耐受能力。将其应用于BALF检测，有望在快速筛查多种病原体的同时，获得每种病原体的拷贝数信息，为混合感染识别和连续载量评估提供数据基础。不过，BALF样本中的黏液及抑制性物质可能影响核酸回收和后续扩增。对于同时覆盖RNA病毒与DNA病原体的多重检测方案，前处理方法还必须兼顾不同类型核酸的完整性。为此，该研究不仅建立了33种病原体检测体系，还系统比较了5种BALF液化方案，筛选出适用于RNA与DNA同步检测的通用前处理流程。

数字PCR工作流程

  该研究建立的dPCR检测方案覆盖13种细菌、12种病毒、5种真菌及3种非典型病原体，并设置人源内参基因。33个检测靶标分配至7个反应管中，每管检测5个靶标。

整体流程包括三个步骤：

1.样本前处理与核酸提取

采用二硫苏糖醇（DTT）对BALF样本进行液化，随后完成自动化核酸提取。

2.反应体系构建

配置多重dPCR反应体系，完成逆转录及芯片加样。

3.自动化检测与数据分析

基于新羿生物D50数字PCR系统，自动完成液滴生成、PCR扩增和液滴信号读取，并通过分析软件计算各靶标的拷贝数。

从样本接收到最终结果输出，整个流程约需2.5小时。

研究结果一：重复性好，高拷贝样本也能稳定定量

  研究比较了生理盐水、DTT、4% NaOH（离心与不离心）及痰液消化液等5种前处理方案。结果显示，4% NaOH虽然液化速度较快，但碱性条件可能影响RNA完整性，不适用于同时覆盖RNA与DNA靶标的综合检测。DTT则能够在有效液化痰液的同时，对RNA病毒、DNA病毒、细菌和真菌均表现出较为一致、均衡的核酸回收效果。

  在分析性能方面，33个靶标的检出限均达到5 copies/test。在10～10⁵ copies/test评估范围内，各靶标的线性相关系数R²均大于0.99；其中27个靶标在全范围内线性良好，其余6个靶标在10～10⁴ copies/test范围内线性良好，10⁵ copies/test作为其检测上限。这些结果表明，该检测方案兼具较低检出限与较宽的定量检测能力。

研究结果二：临床样本阳性检出率高于培养，多病原体检测优势突出

  研究纳入105份疑似肺部感染患者的BALF样本，并将dPCR结果与常规培养进行比较。结果显示，dPCR总体阳性率为96.19%（101/105），显著高于培养法的83.81%（88/105），差异具有统计学意义（P＜0.05）。在混合感染识别方面，dPCR的优势更加明显。对于同时检出2种及以上病原体的样本，dPCR的多病原体检出率为85.71%（90/105），而培养法为40.00%（42/105）。此外，dPCR还能够检测培养难以覆盖的病毒、非培养型及部分苛养病原体，并对低丰度核酸靶标保持较高检测灵敏度，从而提供更全面的病原体谱信息。

研究结果三：与mNGS主要病原体检测结果具有较高一致性

  在29份mNGS验证样本中，dPCR、mNGS和培养法的阳性率分别为89.66%、82.76%和55.17%。其中，在dPCR与mNGS均检出阳性的23份样本中，两种方法对主要病原体的判断一致率为86.96%（20/23），进一步支持了dPCR检测结果的可靠性。对于dPCR未覆盖的罕见或新发病原体，mNGS仍具有广谱筛查价值。dPCR与mNGS可根据临床需求形成互补，为不同场景下的病原学检测提供更多选择。

研究结果四：绝对定量展现动态监测潜力

  研究还对1例重症下呼吸道感染患者进行了探索性分析，回顾性检测其约4个月内连续留取的BALF样本，并对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌进行绝对定量。结果显示，两种病原体的载量变化与患者临床病程及抗感染治疗反应呈平行趋势。在治疗过程中，不同病原体呈现出差异化的载量变化；调整治疗方案后，两种病原体的载量均下降至较低水平。这一单病例结果初步表明，连续dPCR定量有望用于观察不同病原体的载量变化，为评估治疗反应提供更多维度的信息。

小结：从“病原体检出”向“病原体定量与动态评估”

  该研究建立了一种基于新羿生物数字PCR平台的33种呼吸道病原体检测方案，将DTT前处理、自动化核酸提取、多重dPCR检测与绝对定量分析相结合，在约2.5小时内完成BALF样本的多病原体检测。该方案不仅关注“有没有病原体”，还能够进一步回答“每种病原体有多少”，并展现出连续定量“病原体载量如何变化”的技术潜力，为下呼吸道感染的快速病原学诊断、混合感染识别及动态监测研究提供了新工具。