学术文章丨超滤结合数字PCR技术赋能废水SARS-CoV-2 RNA高效检测

清华大学、河北科技大学和天津生态环境检测中心的研究人员联合研究了废水中SARS-CoV-2 RNA的浓缩与检测方法。在此研究中，逆转录数字PCR(RT-dPCR)方法是检测废水中低浓度SARS-CoV-2 RNA的更优选择，检出率更高，且对PCR抑制物具有较好耐受性。研究论文已于近日发表在期刊“Environmental Chemistry Letters”上，影响因子15。

废水监测是追踪社区病毒传播的重要工具，但由于病毒浓度低、环境干扰强，现有方法的可靠性和准确性亟待验证。研究通过对比超滤（ultrafiltration）和共价亲和树脂分离（covalent affinity resin separation）两种浓缩技术，结合逆转录定量PCR（RT-qPCR）和逆转录数字PCR（RT-dPCR）两种检测方法，评估其在废水病毒监测中的性能。实验样本取自清华大学紫荆公寓化粪池的废水（2023年5月），旨在为废水病毒监测提供技术优化方案。

※ 数字PCR技术

数字PCR（dPCR）是继实时荧光定量PCR（qPCR）之后发展的高灵敏度核酸定量分析技术。它通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比，数字PCR技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的无需标准品/标准曲线定量分析。

更高的灵敏度和准确性：数字PCR可以检测到更低浓度的目标病毒，对于监测污水中浓度相对较低的新冠病毒很有价值。

更好的抗干扰性：数字PCR通过将样品分成数万个微滴，可以更好地降低污水中PCR抑制剂的影响，提高检测效率。

无需标准品/标准曲线定量：数字PCR不依赖标准曲线即可定量，更加准确。

研究结果

- 超滤：通过“尺寸排阻”的物理方法对浓缩病毒颗粒及其残留病毒RNA片段到更小的体积中，可更稳定的回收病毒及其残留RNA片段，但同时可能浓缩潜在的PCR抑制物。  

- 共价亲和树脂分离：利用特异性多肽结合病毒表面蛋白（如刺突蛋白RBD），特异性的捕获完整的病毒颗粒，减轻废水中抑制物对下游PCR检测的影响，提高了检测稳定性，但可能因为废水中存在的其他物质或病毒完整性等因素，病毒回收率较低。

- RT-dPCR检测率更高：在超滤浓缩下，RT-dPCR的阳性检出率达77.3%，较RT-qPCR（72.7%）更优；在共价亲和树脂分离下，RT-dPCR检出率为45.5%，显著高于RT-qPCR（36.4%）。  

- 抗干扰能力：RT-dPCR通过分区反应分散抑制剂，减少对扩增的干扰；RT-qPCR因抑制剂影响易出现假阴性或定量偏差。

- 共价亲和树脂分离与RT-qPCR/dPCR的强相关性：两种检测方法在该浓缩技术下的病毒载量结果相关系数为0.70（p≤0.001），表明共价亲和树脂分离可缓解基质干扰。  

- 超滤浓缩下的低相关性：RT-qPCR与RT-dPCR结果相关性较弱，可能与超滤保留更多抑制剂有关。

- 灵敏度更优：具有良好的PCR扩增抑制物耐受性，针对废水等具有复杂基质样本具有更高的检出率，适用于社区病毒流行率低时的早期预警。  

- 定量精准：绝对定量特性无需依赖标准曲线，终点法检测定量情况受PCR扩增抑制影响小，在长期废水病毒监测场景中具有应用潜力。

总结与讨论

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