数字PCR在二代测序质控中的应用

基因检测的主要方法包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）、一代测序（Sanger测序）、荧光原位杂交（FISH）、高通量测序（next generation sequencing, NGS）等。NGS可以一次性检测多个基因、全外显子甚至全基因组区域的所有位点，通量高，在多基因检测中具有优势。但NGS的开展需要专业的知识和技术团队，这是实现NGS检测临床应用价值的前提。除了少数肿瘤小panel NGS检测产品获得医疗器械证书，目前我国和其他国家各实验室所使用的NGS检测多为实验室自建试验（laboratory-developed test, LDT）。这表明NGS检测在临床应用中具有较大的灵活性，但同时表明NGS检测临床应用具有较大的风险性，这给NGS检测实验室的管理、人员培训和质量控制（包括检测实验和生物学信息分析）等都带来很大的压力。因此，通过其他技术平台和方法对NGS检测过程及检测结果进行有效质控非常重要。数字PCR技术是NGS平台质控的一个有力工具，在NGS测序文库精确定量和结果验证等方面具有广泛应用。《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》（2018年版）中就明确规定，对于可疑结果，需要进行人工校对，并采用Sanger测序、ARMS-PCR、数字PCR等方法进行验证。

NGS在测序过程中，由于试剂差异、人员操作、仪器维护等因素，实际的捕获效率和覆盖度会与期望值存在偏差，可能会捕获到非目标区域序列，也可能漏捕目标区域序列。非目标区域序列对于靶向测序没有意义，而脱靶序列会导致测序信息缺失。因此，对于任何检测项目，每一次测序必须给出靶向区域的覆盖度统计，这是衡量测序质量的重要指标之一。当覆盖度过低时，则需补测数据或对样本重测，同时对可疑数据用数字PCR等方法进行验证。

新羿TD-1数字PCR平台在NGS测序结果验证和质控中均有广泛的应用，其操作步骤简单，结果准确可靠。

新羿TD-1数字PCR平台基因检测流程

案例一：某公司在用NGS进行肿瘤突变基因检测时，使用两个panel进行检测，测序结果PIK3CA基因突变一个panel检测的突变率为16%，另一个panel检测的突变率为30%，二者差异较大，通过数字PCR验证后，突变率为16%，进一步确认了其中一个panel的准确性。该现象可能是由测序错误、比对错误等原因导致的, 从而造成得到的突变频率可能会存在较大偏移。而非真实的突变频率会对肿瘤异质性、克隆演化等研究数据产生重要影响。

案例二：第三方检验所在进行室间质评项目评估时，用NGS检测室间质评样本时，对于低于1%的样本不确定是否是真正的阳性样本，需要通过数字PCR进行验证，数字PCR检测结果为0.4%，则确认该样本为阳性样本。因此，目前NGS商业报告通常按2%报告结果，一般1%也可以确定，但最好对5%或2%以下的样本通过数字PCR进行验证，可以进一步保证结果准确性。

案例三：某测序公司在建立新项目时，使用NGS参考品对panel进行验证，其中EGFR基因20外显子插入突变未报阳性结果，与参考品理论值不符合，用数字PCR对参考品进行检测后，发现20外显子插入突变为阳性，突变率为50%，验证参考品没问题，进一步对数据分析流程进行人工校正，最终发现是算法出现问题，后修正算法，解决了20外显子插入突变的检测问题。

综上所述，在实际临床应用中, 我们必须掌握NGS技术中生物学数据质量控制的重要质控环节和影响因素，进行测序结果验证, 只有通过验证过程才能找到最适合检测项目的最优分析方案，包括软件的选择和参数的设置，从而使NGS成为临床检测和科学研究的一个成熟检测平台。