数字PCR在二代测序质控中的应用
基因检测的主要方法包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、一代测序(Sanger测序)、荧光原位杂交(FISH)、高通量测序(next generation sequencing, NGS)等。NGS可以一次性检测多个基因、全外显子甚至全基因组区域的所有位点,通量高,在多基因检测中具有优势。但NGS的开展需要专业的知识和技术团队,这是实现NGS检测临床应用价值的前提。除了少数肿瘤小panel NGS检测产品获得医疗器械证书,目前我国和其他国家各实验室所使用的NGS检测多为实验室自建试验(laboratory-developed test, LDT)。这表明NGS检测在临床应用中具有较大的灵活性,但同时表明NGS检测临床应用具有较大的风险性,这给NGS检测实验室的管理、人员培训和质量控制(包括检测实验和生物学信息分析)等都带来很大的压力。因此,通过其他技术平台和方法对NGS检测过程及检测结果进行有效质控非常重要。数字PCR技术是NGS平台质控的一个有力工具,在NGS测序文库精确定量和结果验证等方面具有广泛应用。《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》(2018年版)中就明确规定,对于可疑结果,需要进行人工校对,并采用Sanger测序、ARMS-PCR、数字PCR等方法进行验证。
NGS在测序过程中,由于试剂差异、人员操作、仪器维护等因素,实际的捕获效率和覆盖度会与期望值存在偏差,可能会捕获到非目标区域序列,也可能漏捕目标区域序列。非目标区域序列对于靶向测序没有意义,而脱靶序列会导致测序信息缺失。因此,对于任何检测项目,每一次测序必须给出靶向区域的覆盖度统计,这是衡量测序质量的重要指标之一。当覆盖度过低时,则需补测数据或对样本重测,同时对可疑数据用数字PCR等方法进行验证。
新羿TD-1数字PCR平台在NGS测序结果验证和质控中均有广泛的应用,其操作步骤简单,结果准确可靠。
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新羿TD-1数字PCR平台基因检测流程
案例一:某公司在用NGS进行肿瘤突变基因检测时,使用两个panel进行检测,测序结果PIK3CA基因突变一个panel检测的突变率为16%,另一个panel检测的突变率为30%,二者差异较大,通过数字PCR验证后,突变率为16%,进一步确认了其中一个panel的准确性。该现象可能是由测序错误、比对错误等原因导致的, 从而造成得到的突变频率可能会存在较大偏移。而非真实的突变频率会对肿瘤异质性、克隆演化等研究数据产生重要影响。
案例二:第三方检验所在进行室间质评项目评估时,用NGS检测室间质评样本时,对于低于1%的样本不确定是否是真正的阳性样本,需要通过数字PCR进行验证,数字PCR检测结果为0.4%,则确认该样本为阳性样本。因此,目前NGS商业报告通常按2%报告结果,一般1%也可以确定,但最好对5%或2%以下的样本通过数字PCR进行验证,可以进一步保证结果准确性。
案例三:某测序公司在建立新项目时,使用NGS参考品对panel进行验证,其中EGFR基因20外显子插入突变未报阳性结果,与参考品理论值不符合,用数字PCR对参考品进行检测后,发现20外显子插入突变为阳性,突变率为50%,验证参考品没问题,进一步对数据分析流程进行人工校正,最终发现是算法出现问题,后修正算法,解决了20外显子插入突变的检测问题。
综上所述,在实际临床应用中, 我们必须掌握NGS技术中生物学数据质量控制的重要质控环节和影响因素,进行测序结果验证, 只有通过验证过程才能找到最适合检测项目的最优分析方案,包括软件的选择和参数的设置,从而使NGS成为临床检测和科学研究的一个成熟检测平台。