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发布时间: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 样本制备仪采用光、机、电一体化设计,配套具有自主知识产权的微流控芯片,可以将水相样本快速制备成纳升体积的液滴。液滴数与样本体积相关,30微升样本可制备约5万个液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR扩增后保持稳定。产品说明起始样本量(μL)20-50制备通量1-8个样本制备时间4min / 8样本每 30 μL 样本液滴数约50000个仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
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Chip Reader 生物芯片分析仪采用光、机、电一体化设计,及激光共聚焦原理,配套有自主知识产权的微流控芯片,可以准确快速地定位、识别纳升体积微液滴,获取其荧光信号值。经过泊松统计分析,提供研究者所需的阳性、阴性液滴数绝对数值,从而推算出起始靶标核酸分子的精确浓度。Chip Reader  生物芯片分析仪兼容Taqman水解探针和EVAGreen检测。产品说明阅读通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)阅读通量1-8个样本阅读时间20min / 8样本仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
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数字PCR在DNA甲基化检测中的应用

日期: 2020-03-27
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数字PCR在DNA甲基化检测中的应用


DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰之一,发生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上,多发生于CpG岛上,研究发现,DNA甲基化参与调节多种细胞过程,包括胚胎发育,转录,X染色体失活,基因组印迹、染色体稳定性等。


许多研究发现,DNA甲基化在一系列的疾病(如癌症等)起到十分重要的作用。在癌症患者中,与正常人体相比,DNA甲基化多发生两个变化:1、启动子区域CpG岛的高甲基化,导致肿瘤抑制基因沉默;2:重复区域的低甲基化,导致基因组不稳定1,2

数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

图1:DNA甲基化与癌症的关系1


DNA甲基化的改变多发生于癌症早期,在某些特定癌症中,检测特异的甲基化标志物有助于癌症的早期发现,进而大大提高癌症患者的生存率。目前,美国国家癌症协会(ACS)在最近更新的结直肠癌筛查指南中建议每3年做一次多靶点粪便DNA的甲基化检测。因此,急需找到一个灵敏度高、特异性强、操作简单快捷的方法对临床样本DNA甲基化进行检测。


微液滴数字PCR (ddPCR)是近年来PCR技术的一项新进展,通过微液滴化,终点PCR和泊松分布,数字PCR无需标准曲线即可实现核酸浓度的绝对定量。与实时定量PCR技术(qPCR)对比,数字PCR具有灵敏度高,准确度高、精密度高、重复性高,对PCR抑制剂耐受度高的优势。


目前,Dawne N等人3使用数字PCR进行DNA甲基化的检测。结果显示,数字PCR方法可检出低至0.5%的SNRPN启动子甲基化,其线性R2可达到0.9903,且两次完全独立的实验重复性极强。

数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

图2:ddPCR检测DNA甲基化的灵敏度、线性范围3


数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

图3:ddPCR检测DNA甲基化的稳定性

(A、B为两次完全独立实验)3


使用ddPCR方法检测VIM基因启动子DNA甲基化,其最低灵敏度可达到0.03%,线性R2可达到0.9998。且将ddPCR结果与NGS检测结果对比,一致性强,所用DNA量更少。


Liesbeth Van Wesenbeeck等人4使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化线性检测时,图4对比结果显示,在检测低拷贝DNA时,ddPCR准确性较qPCR更高。

数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用

图4:ddPCR(左图)与qPCR(右图)测试高拷贝

(1157拷贝/反应,上图)与低拷贝(222拷贝/反应,下图)

DNA甲基化实测值与理论值之差与理论值关系图4


综上所述,使用ddPCR方法进行DNA甲基化分析时,其灵敏度高,稳定性高,准确性高,可用于检测血浆游离DNA、FFPE DNA等多种样本来源的DNA的甲基化状态。因此,基于ddPCR的甲基化检测技术将来有潜力应用于肿瘤甲基化标志物的检测中,辅助临床诊断和治疗,应用于肿瘤早诊和筛查领域。


新羿生物专注于微液滴数字PCR全链条自主研发,包括芯片、仪器、试剂、软件等核心产品,目前已申请专利50余项,开发产品数十项。新羿生物的试剂类产品不仅可以在新羿TD-1数字PCR平台上使用,而且可以在其他商用微液滴数字PCR平台上使用,灵敏度高,特异性好,重复性高。新羿生物的微液滴数字PCR技术在检测过程中全程封闭检测,不需转移液滴,可避免交叉污染,方便、准确、灵敏。


随着人民生活水平的提高,我国结直肠癌(Colorectal Carcinoma, CRC)发病率逐年升高,现在我国发达地区CRC已经是发病率居第二位的恶性肿瘤,成为威胁我国人民健康的一种重大疾病,但是CRC发展相对缓慢,可以通过早期发现而得到根治及预防。新羿结直肠癌甲基化基因检测试剂盒采用Methyl-ddPCR技术,以CRC粪便样本DNA为检测对象,对CRC粪便样本中多个基因的甲基化状态同时进行检测,从而辅助临床早期诊断结直肠癌。



参考文献:

1、Keith D. Robertson, “DNA methylation and human disease”. Nature Reviews: Genetics. 2005; 6: 597-610.

2、Ernst J. Kuipers, et al. “Colorectal cancer”. Nature Reviews: Disease Primers. 2015; 1: 1-25.

3、Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”. https://www.researchgate.net/publication/263043581.

4、Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.




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