知识中心

News
推荐产品 / Products
发布时间: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 样本制备仪采用光、机、电一体化设计,配套具有自主知识产权的微流控芯片,可以将水相样本快速制备成纳升体积的液滴。液滴数与样本体积相关,30微升样本可制备约5万个液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR扩增后保持稳定。产品说明起始样本量(μL)20-50制备通量1-8个样本制备时间4min / 8样本每 30 μL 样本液滴数约50000个仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
发布时间: 2017 - 07 - 18
Chip Reader 生物芯片分析仪采用光、机、电一体化设计,及激光共聚焦原理,配套有自主知识产权的微流控芯片,可以准确快速地定位、识别纳升体积微液滴,获取其荧光信号值。经过泊松统计分析,提供研究者所需的阳性、阴性液滴数绝对数值,从而推算出起始靶标核酸分子的精确浓度。Chip Reader  生物芯片分析仪兼容Taqman水解探针和EVAGreen检测。产品说明阅读通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)阅读通量1-8个样本阅读时间20min / 8样本仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
联系我们
电话: 0755-2955 6666
邮箱: eims@qiwang.cn
地址: 中国深圳宝安中心区宝 源路F518时尚创意园15栋3层

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用

日期: 2020-03-27
浏览次数: 84

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用


肺癌是世界上最常见的的恶性肿瘤之一,每年全球发病人数已经超过160万,分为非小细胞肺癌(non small cell carcinoma,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell carcinoma,SCLC),其中前者约占80%。超过一半的非小细胞肺癌患者在被发现时已经是晚期,无法进行手术治疗,以往只能采用铂类药物进行化疗,疗效差,且毒副作用大。随着分子诊断技术的发展,精准医疗时代已经来临,EGFR、ALK、ROS1、KRAS等作为肺癌驱动基因被发现,美国国立综合癌症网络 (National Comprehensive Cancer Network, NCCN) 指南中建议对NSCLC患者进行多种与NSCLC高度相关的驱动基因的并行检测,制定安全有效的个性化治疗方案。


表皮生长因子 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是NSCLC中最常见的驱动基因,常见的与其相关的靶向药物有酪氨酸酶抑制剂类药物厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼及奥希替尼等。ALK (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 融合基因是NSCLC中第二常见的驱动基因,ALK编码酪氨酸激酶受体蛋白,属于胰岛素受体超家族,除了脑组织之外,表达量自出生后下降至低水平,在正常的肺组织中并不表达,其3'端酪氨酸激酶区可与多种伴侣发生融合,使ALK基因的3'端实现了高表达(图1)1

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用

图1. ALK融合基因野生型和突变型的

5'和3'端扩增实验1


最常见的融合伴侣是棘皮动物微管相关类蛋白4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4),EML4-ALK融合基因于2007年由日本学者Soda2发现并证实其为肺癌驱动基因(图2),EML4氨基末端螺旋结构域可促进ALK同源二聚体的形成与活化,引起PI3K-AKT、RAS-MAPK和JAT-ATAT信号通路的活化,进而导致肿瘤细胞异常增殖分化并抑制凋亡。EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和p23上,根据其断裂位点的不同可分为多种突变型,其中以V1 (A20;E13) 和V3a/b (A20;E6a/b)突变型最为常见。除了EML4之外,亦有多种其他罕见的融合伴侣,如KIF5B、TFG、HIP1、KLC1等。针对肿瘤诱发机制的酪氨酸激酶抑制剂类的一代靶向药物克唑替尼、二代靶向药物艾乐替尼、色瑞替尼、Brigatinib和三代靶向药物Loratinib等靶向药物已经问世,为众多的NSCLC患者带来了福音,减轻了患者的痛苦,但所有患者在服用靶向药物1年内都会出现耐药现象,最容易出现中枢神经系统转移现象。耐药机制复杂多变,包括ALK激酶区域的C1156Y、L1196M、G1269A、G1202R、S1206Y、I1171T等二次突变、ALK融合基因拷贝数的扩增、信号旁路的激活等3。近几年,有若干学者对EML4-ALK的不同突变型及不同的融合伴侣进行了靶向药物的敏感性及耐药性研究,发现其会影响靶向药物的疗效,EML4-ALK不同变体会导致不同的蛋白质结构稳定性及对ALK抑制剂的敏感性,一些罕见的融合伴侣的疗效要优于EML4-ALK,而一些罕见的融合伴侣会发生原发性耐药4,如DTNB-ALK、NR_110271-ALK、ZC3H8-ALK和STED2-ALK。随着更多的靶向药物的出现及临床试验的开展,更多融合基因的疗效规律将会被证实,与之相关的药物靶点的精准检测成为当务之急。

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用

图2. EML4-ALK肺癌驱动基因研究实验2


传统的ALK融合基因的检测方法有荧光原位杂交法(FISH)、免疫组织化学法(IHC)、逆转录荧光PCR法(RT-PCR)。随着分子诊断技术的发展,近年来高通量测序(NGS)和数字PCR(dPCR)技术逐渐被应用到临床的分子检测。五种方法的优劣势比较如下表:

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用

Qiushi Wang等人5使用FISH和数字PCR对103名肺癌患者的FFPE样本进行检测,FISH检测出14例阳性患者,其中13例经数字PCR检测为阳性,数字PCR漏检的1例,经靶向测序确定为KIF5B-ALK融合基因,数字PCR引物未覆盖。同时,数字PCR另外发现16例ALK融合基因低拷贝样本,这16例标本因检测值小于FISH的阳性cutoff值(肿瘤细胞占比15%)而被确定为阴性。16例ALK融合低拷贝的患者中,有两例患者在化疗失败后接受了克唑替尼治疗,一例患者(ALK融合比例10%)部分缓解,PFS为7个月;另一例患者(ALK融合比例8%)疾病稳定,PFS为5个月。通过这个研究,数字PCR充分体现了其高灵敏度和绝对定量的优势。吴一龙教授曾发现EGFR突变丰度与EGFR TKI疗效相关,在ALK融合突变中,可能也存在同样的规律。但突变丰度与疗效的阈值定在多少,目前并没有统一的共识,其中一个重要原因是以前方法的定量能力不足,而数字PCR有望弥补这一不足。


综上所述,数字PCR技术灵敏度高、特异性强、重复性好、可绝对定量的优点,在ALK等肿瘤基因的临床检测中有广阔的应用前景,可以对患者的肿瘤发生、发展全过程进行动态监测,确定最佳的治疗方案,实现临床全过程的“精准医疗”。


新羿生物专注于微液滴数字PCR全链条自主研发,包括芯片、仪器、试剂、软件等核心产品,目前已申请专利50余项,开发产品数十项。新羿生物的试剂类产品不仅可以在新羿TD-1数字PCR平台上使用,而且可以在其他商用微液滴数字PCR平台上使用,灵敏度高,特异性好,重复性高。新羿生物的微流控芯片数字PCR技术在检测过程中全程封闭检测,不需转移液滴,可避免交叉污染,方便、准确、灵敏。


新羿ALK融合基因检测试剂盒采用RT-ddPCR技术,以非小细胞肺癌(NSCLC)样本RNA为检测对象,对NSCLC中存在的多种ALK基因融合类型同时进行检测,从而辅助临床更全面选择出可受益于克唑替尼的NSCLC患者。适用于NSCLC患者在进入靶向治疗之前使用,为肿瘤患者个体用药提供科学依据。试剂盒可对ALK基因常见融合位点进行准确检测,检测灵敏度达到0.1-1ng RNA,检测结果如下图所示。

数字PCR在ALK融合基因检测中的应用

图3. 新羿ALK融合基因检测试剂盒检测结果



参考文献:

1. Rui Wang, et al. “The Use of Quantitative Real-Time Reverse Transcriptase PCR for 5’ and 3’ Portions of ALK Transcripts to Detect ALK Rearrangements in Lung Cancers”. Clinical Cancer Research. 2012;  18(17): 4725-6079.

2. Manabu Soda, et al. “Identification of the Transforming EML4-ALK Fusion Gene in Non-small-cell Lung Cancer”. Nature.  2007; 448 (7153): 561-566.

3. Kathryn C. Arbour, et al. “Diagnosis and Treatment of ALK Positive NSCLC”.Hematolgy Oncology Clinics of North America. 2017; 31(1): 101-111.

4. Jin Kang, et al. “Uncommon ALK Fusion Partners in Advanced ALK-positive Non-small-cell Lung Cancer”. Journal of Clinical Oncology. 2018; http://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/ JCO.2018.36.15_suppl.8561.

5. Qiushi Wang, et al. ”Droplet Digital PCR for Absolute Quantification  of  EML4-ALK Gene Rearrangement in Lung Adenocarcinoma”. The Journal of Molecular Diagnostics. 2015; 5(17): 515-520.



上一篇:无下一篇:无
相关新闻 / Related News More
联系我们
地址:北京市海淀区成府路268号中科科仪大厦5号楼305室
电话:010-82481061
邮箱:info@targetingone.com
 
Copyright ©2017 - 2024 北京新羿生物科技有限公司
犀牛云提供企业云服务