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发布时间: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 样本制备仪采用光、机、电一体化设计,配套具有自主知识产权的微流控芯片,可以将水相样本快速制备成纳升体积的液滴。液滴数与样本体积相关,30微升样本可制备约5万个液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR扩增后保持稳定。产品说明起始样本量(μL)20-50制备通量1-8个样本制备时间4min / 8样本每 30 μL 样本液滴数约50000个仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
发布时间: 2017 - 07 - 18
Chip Reader 生物芯片阅读仪采用光、机、电一体化设计,及激光共聚焦原理,配套有自主知识产权的微流控芯片,可以准确快速地定位、识别纳升体积微液滴,获取其荧光信号值。经过泊松统计分析,提供研究者所需的阳性、阴性液滴数绝对数值,从而推算出起始靶标核酸分子的精确浓度。Chip Reader  生物芯片阅读仪兼容Taqman水解探针和EVAGreen检测。产品说明阅读通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)阅读通量1-8个样本阅读时间20min / 8样本仪器尺寸(宽 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
发布时间: 2017 - 08 - 14
数字PCR耗材分为微液滴样本制备通用试剂盒(包含微液滴生成芯片、微液滴生成油、微液滴生成芯片密封垫、8联排管及8联排管盖),以及微液滴检测通用试剂盒(包含微液滴检测芯片、微液滴检测油及微液滴检测芯片密封垫),用于配套Drop Maker 样本制备仪,将水相溶液样本制备为纳升体积液滴,并通过Chip Reader 生物芯片阅读仪对微液滴进行定量检测。产品说明起始样本量(μL)20-50芯片通量8个样本池(可单独使用)
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数字PCR在移植排斥监控中的应用

日期: 2018-11-23
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数字PCR在移植排斥监控中的应用

器官移植是治疗器官衰竭的最佳方法之一,对于末期器官病变患者更是唯一有效的治疗方式。常见移植器官包括心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胰脏和小肠。据统计,2017年我国实施器官移植手术超过1.6万例,随着公民逝世后自愿捐献例数不断增加,器官移植手术量呈逐年上升趋势,移植手术的质量也大幅提升。然而,移植排斥反应仍然是这一领域的一大难题,是导致移植手术失败的重要原因。器官移植后,由于供、受者之间的组织抗原不同,移植物刺激受者的免疫系统发生免疫应答,引发排斥反应。树突状细胞(DC)在免疫应答过程中提呈抗原,激活受体T细胞,T细胞对同种异体移植物识别并活化,介导免疫应答,通过多种机制破坏、杀伤移植物(图一)。


数字PCR在移植排斥监控中的应用

图一:移植排斥反应机制(来源:Ayala-García MA, et al. (2012) “The Major Histocompatibility Complex 

in Transplantation”. Journal of transplantation.)

数字PCR在移植排斥监控中的应用

虽然免疫抑制剂的使用可以避免排斥反应的发生从而增加移植物的存活率,但是它们大多具有一些副作用,应尽可能减少其用量。因此,术后监控,特别是对移植排斥的监控,对于器官移植受者的长期存活至关重要。通过监测患者的术后状态,可以为其设计个性化的治疗方案,从而避免过多的使用免疫抑制剂,同时,亦可为高反应患者提供足够的药物来控制排斥反应,进一步提高手术的成功率和存活率。目前临床上用于监控移植排斥的“金标准”为侵入式的组织活检,通过组织病理学来确认存在的损伤类型和程度。然而,组织活检存在这些问题:可能导致相关组织受损、引起并发症、具有取样误差、费用昂贵。因此,此方法不适合用于持续监控患者状况以及时调整治疗方案。


近年来,研究人员在受者血液和尿液中发现了供者来源的游离DNA(donor-derived cell-free DNA, ddcfDNA),这些ddcfDNA随着移植物中的细胞坏死或凋亡而释放出来,若受者的免疫系统对移植物产生排斥反应,则ddcfDNA的水平将居高不下。由此可见,ddcfDNA可作为排斥反应的标记物,对其水平进行监控可提示受者术后的健康状况(图二)。然而,ddcfDNA仅占受者血液和尿液中游离DNA的一小部分,如何分辨出ddcfDNA及对其进行精确的定量无疑是一大挑战。





数字PCR在移植排斥监控中的应用






图二:ddcfDNA作为排斥反应标记物(来源:https://www.elsevier.com/about/press-releases/research-and-

journals/new-non-invasive-assay-may-improve-surveillance-of-heart-and-other-solid-organ-transplants)

数字PCR在移植排斥监控中的应用

其中,最直接的方式是以Y染色体作为供者的标记物进行检测,适用于女性受者与男性供者的移植监控。Sigdel等人2利用数字PCR(dPCR)检测63例肾脏移植女性受者的尿液样本中的Y染色体(供者为男性)。实验结果显示,急性排斥(AR)与BK病毒性肾病(BKVN)受者尿液中的Y染色体含量显著高于稳定移植(STA)与慢性移植物损伤(CAI)受者的Y染色体含量(图三)。由此说明Y染色体ddcfDNA可作为一种移植排斥监控的生物标记物。但是,该策略仅限于约25%的移植人群,其临床应用受到限制。

数字PCR在移植排斥监控中的应用

:移植患者尿液样本中Y染色体dPCR检测结果 2

数字PCR在移植排斥监控中的应用

适用性更广的方法是利用遗传多态性来进行ddcfDNA的定量,例如可以通过受者和供者的单核苷酸多态性(SNP)来确定ddcfDNA的百分比。Beck等人3设计了41个探针组,选取合适的SNP位点(受者为纯合子、供者为杂合子或与受者不同的纯合子)并利用微液滴数字PCR(ddPCR)对其进行检测,最终确定ddcfDNA的含量。结果表明,进行肝脏、肾脏和心脏移植且情况稳定的患者,ddcfDNA含量分别小于6.8%,2.5%和3.4%,而出现排斥反应的患者ddcfDNA含量超过60%。


目前报道的文献中用于检测ddcfDNA的技术主要有三种,分别是实时荧光定量PCR(qPCR)、dPCR和NGS法,它们的灵敏度、成本及检测时间的比较如下:

检测技术

灵敏度

精准定量

成本

检测时间

qPCR

+++

++

$

< 3 h

dPCR

++++

++++

$$

6 h

NGS

++++

++++

$$$

>5天

dPCR作为一种高灵敏度、能够实现绝对定量的技术,比之qPCR更适合用于含量较低的ddcfDNA的定量,其检测结果更准确。虽然NGS法也有较高的灵敏度,但其仪器成本与技术门槛较高,且耗时较长,不适合在一般临床实验室开展。综合来看,dPCR可能更适合应用于临床进行移植排斥的监控,这种非侵入式的监控方式能够解决上述传统方法存在的问题,提高移植的成功率及存活率,令人期待。


参考文献:

  1. Gielis EM, et al. (2015) “Cell-Free DNA: An Upcoming Biomarker in Transplantation”. American Journal of Transplantation.

  2. Sigdel TK, et al. (2013) “A Rapid Noninvasive Assay for the Detection of Renal Transplant Injury”. Transplantation.

  3. Beck J, et al. (2013) “Digital Droplet PCR for Rapid Quantification of Donor DNA in the Circulation of Transplant Recipients as a Potential Universal Biomarker of Graft Injury”. Clinical Chemistry.



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