学术文章丨数字PCR助力血浆中巨细胞病毒和EB病毒双重精准定量

发布日期：2026-05-14

首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心于艳华教授团队深耕感染性疾病与肝病精准诊断领域，近日在国际权威期刊《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》发表重要研究论文。该研究基于新羿数字PCR平台，成功建立并优化了一种能够同时检测血浆中巨细胞病毒（CMV）和EB病毒（EBV）的双重微滴数字PCR（ddPCR）检测体系。该方法攻克了传统qPCR技术依赖标准曲线、灵敏度不足、易受抑制物干扰等痛点，为免疫受损人群（如移植患者）中两种病毒的共感染精准监测、早期诊断和指导临床治疗提供了强有力的技术工具。

研究目的

巨细胞病毒（CMV）和EB病毒（EBV）是两种全球高感染的疱疹病毒。在免疫功能低下的人群（如器官移植、HIV感染者）中，这两种病毒的共感染或双重再激活十分常见，会协同增加移植物排斥、淋巴增殖性疾病（PTLD）等严重并发症的风险，显著降低患者生存率。

传统的血清学方法存在“窗口期”且不适用于免疫受损人群，而目前主流的实时荧光定量PCR（qPCR）技术依赖标准曲线进行相对定量，在检测低浓度样本时灵敏度、精密度和抗干扰能力均存在局限。本研究旨在开发一种基于新羿数字PCR平台的双重、单管、绝对定量检测体系，一次加样即可同时精准检测CMV和EBV，为临床提供更优的监测方案。

研究方法

本研究首先针对CMV的UL54基因和EBV的EBNA-1基因的保守区域，设计了特异性引物和TaqMan探针（FAM通道检测CMV，VIC通道检测EBV）。在新羿数字PCR平台上，通过对引物探针浓度、退火温度等关键参数进行系统优化，成功建立了双重ddPCR反应体系。随后，研究对该方法进行了全面的方法学验证，包括动态范围、灵敏度、特异性、重复性、抗干扰能力，并与传统的qPCR方法及临床参考方法进行了头对头的临床样本性能比较。

研究结果

※ 灵敏度卓越，比qPCR高6-7倍

方法学验证结果显示，该双重ddPCR方法的动态范围在10^0~10^5 copies/μL之间，线性关系良好（R²>0.99）。在灵敏度方面，ddPCR表现尤为突出：其对CMV和EBV的检测下限（LOD）分别低至7.9 copies/反应和6.5 copies/反应，相较于使用相同引物探针的qPCR方法（LOD为53.4和45.6 copies/反应），灵敏度提升了约6-7倍。同时，其定量下限（LOQ）也远优于qPCR，实现了“检出即定量”的精准性能。

※ 无竞争抑制，双重检测结果可靠

为评估双重检测时两个靶标是否存在相互干扰，研究对比了单重与双重模式下的检测结果。结果显示，在低浓度（10^1 copies/μL）和中浓度（10^2 copies/μL）下，两种模式的定量结果均无统计学差异（p>0.05），CMV和EBV的回收率均在88%-116%之间，充分证明该双重体系反应兼容性良好，无明显的竞争性抑制。

※ 特异性100%，无交叉反应

该双重ddPCR方法对包括其他疱疹病毒（HSV-1、HSV-2、VZV、HHV-6B）、呼吸道病毒（SARS-CoV-2、流感）、肝炎病毒（HBV、HCV）以及多种临床常见细菌真菌在内的20种非靶标病原体进行检测，均无非特异性信号产生，仅在加入CMV或EBV阳性对照时出现特异性微滴，表明其分析特异性高达100%。

※ 抗干扰能力强，适应复杂临床样本

针对高脂血症和高胆红素血症等常见的内源性干扰物质，研究进行了耐受性评估。结果显示，在这些复杂背景下，低浓度病毒样本的回收率在89.9%至113%之间，均落在85%-115%的可接受范围内，证明了该方法在复杂临床血浆样本（如肝移植患者）中仍能提供准确、稳定的定量结果。

※ 临床验证表现优异，检出率高

在117例临床疑似患者血浆样本的验证中，以商品化qPCR试剂盒为参考标准，该双重dPCR方法展现出了100%的临床灵敏度和100%的临床特异性，与参考方法定性结果完全一致。更重要的是，ddPCR成功检出了4例被同源qPCR方法漏检的弱阳性样本（1例CMV，3例EBV），进一步证实了其卓越的低载量样本检测能力。

※ 定量一致性好，与临床金标准高度相关

对阳性样本的定量结果进行线性回归分析显示，该双重dPCR方法与商品化qPCR试剂盒的定量结果具有高度相关性，CMV和EBV的R²值分别为0.8674和0.7972。这表明新羿dPCR方法不仅能更灵敏地“定性”，其绝对定量结果也与临床金标准保持了良好的一致性。

总结与讨论

本研究成功建立并验证了一种基于新羿数字PCR平台的双重ddPCR方法，用于血浆中CMV和EBV的同步、绝对定量检测。该方法在灵敏度、抗干扰能力、定量精准度以及单管双重检测的效率上均显著优于传统qPCR技术。

通过临床样本验证，该方法不仅与现有临床方法高度一致，更能发现被漏检的低载量样本，对于免疫受损人群的病毒再激活或共感染的早期预警、精准监测和指导抢先治疗具有重要的临床应用价值。同时，其抗干扰能力强的特点，使其在复杂临床样本（如肝病、移植患者）的检测中更具优势。该方法为病毒性感染的精准诊断提供了一个强大的新工具。

原文链接：

https://doi.org/10.3389/fcimb.2026.1798127