学术文章丨数字PCR赋能线粒体糖尿病 m.3243A>G 异质性精准定量

发布日期：2026-05-14

近日，中日友好医院临床检验科马亮、曹永彤团队联合北京新羿生物科技有限公司在国际期刊《Journal of Diabetes Research》发表学术论文。该研究基于新羿数字PCR平台，成功建立并优化了线粒体DNA m.3243A>G异质性检测体系。该方法攻克了传统检测技术灵敏度低、定量不准、样本适应性差等痛点，为线粒体糖尿病（MDM）的早期筛查、精准诊断及遗传咨询提供了高效、可靠、低成本的解决方案。

研究目的

线粒体DNA m.3243A>G变异是线粒体糖尿病（MDM）最常见的致病原因，但由于该变异在体内存在异质性（即突变型与野生型mtDNA共存），且在不同组织中的比例差异显著，传统检测方法（如Sanger测序、PCR-RFLP）灵敏度不足、定量不精准，易导致漏诊或误判。

本研究旨在建立一种基于数字PCR（dPCR）的m.3243A>G异质性定量方法，通过系统的方法学验证，明确其在灵敏度、特异性、准确性和重复性方面的技术性能；并通过临床样本检测，评估其在外周血及尿液沉渣样本中的实际应用价值，为MDM的精准诊断和早期筛查提供可靠技术工具。

研究方法

本研究首先针对线粒体DNA m.3243A>G位点设计了特异性双探针（FAM标记突变型、VIC标记野生型）的数字PCR检测体系，并利用质粒标准品对该方法的动态范围、灵敏度、特异性、准确性及重复性进行了系统的方法学验证。在临床应用层面，研究纳入了1506例早发型糖尿病患者的血液和尿液沉渣样本，采用建立的数字PCR方法进行异质性检测，并将结果与Sanger测序及NGS测序进行对比，以评估其在真实临床样本中的检测性能与定量准确性。

研究结果

※ 特异性强，无交叉干扰

对野生型m.3243A质粒、突变型m.3243G质粒及50%混合质粒的检测结果显示，仅突变型出现FAM信号、野生型出现VIC信号、混合型双信号同时出现，比例与预期一致。对9种其他线粒体基因变异的检测结果均100%符合预期，无交叉干扰，证实该方法特异性极强。

※ 动态范围宽，线性关系良好

在10～10⁵copies/μL浓度范围内，对m.3243A、m.3243G及50%混合质粒的检测均呈良好线性关系，R²值分别为0.9999、0.9982和0.9953，表明该方法定量线性范围可覆盖临床样本常见浓度区间。

※ 灵敏度极佳，可检出0.05%的低丰度变异

通过20次重复检测0.05%异质性率的质粒标准品，突变型m.3243G检出率为100%，确定该方法的最低检测限（LoD）为0.05%，远优于Sanger测序。

※ 准确性高，异质性定量可靠

对0%、0.5%、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%梯度异质性标准品的检测结果显示，实测值与理论值高度一致，相关系数R²>0.98，证明该方法可在0%～100%全范围内精准定量异质性率。

※ 重复性稳定，符合临床规范

对低异质性率（0.5%）和中异质性率（50%）分别进行20次重复检测，批内变异系数（CV）分别为18.5%和2.4%，批间CV分别为21.3%和3.8%，均≤25%，满足方法学可接受标准。临床应用效果显著，检出率远超传统方法

※ 临床应用效果显著，检出率远超传统方法

在1506例早发型糖尿病患者中，采用dPCR方法检出异质性率>5%者12例（0.80%），1%～5%者6例（0.40%），另有9例异质性率在0.1%～1%之间。其中仅1例此前临床诊断为MDM，其余携带者缺乏典型症状。与Sanger测序对比，dPCR可检出低至0.1%的异质性，而Sanger测序因峰图干扰无法准确判读<10%的样本；与NGS对比，dPCR定量结果高度一致，验证了其准确性。

总结与讨论

本研究建立的数字PCR检测方法在灵敏度、绝对定量能力、样本适应性及检测成本方面均显著优于传统Sanger测序、NGS及qPCR等技术。通过1506例早发型糖尿病患者的临床筛查，该方法共检出异质性率>1%的携带者18例，其中仅1例此前被临床疑诊为线粒体糖尿病，其余携带者缺乏典型临床症状，提示单纯依赖临床特征进行诊断极易漏诊，对早发型糖尿病患者开展常规基因筛查具有重要临床意义。

基于该方法精准、简便、低成本的特点，研究者提出阶梯式诊断策略：将dPCR作为一线筛查工具，阳性者可直接确诊，阴性者再行全线粒体基因组测序，可显著提升诊断效率与成本效益。该方法不但为线粒体糖尿病的精准筛查与诊断提供了可靠技术工具，也为其他线粒体DNA异质性疾病的检测方法开发提供了重要参考。

原文链接：

https://doi.org/10.1155/jdr/9298888