学术文章丨新羿数字PCR技术赋能布鲁氏菌病精准防控

发布日期：2025-12-19

近日，山东省动物疫病预防与控制中心联合山东农业大学、山东师范大学、山东省农业科学院等多家单位，在国际期刊《Frontiers in Microbiology》发表题为“Establishment of a dual droplet digital PCR method for detecting the Brucella abortus A19-ΔVirB12 strains”的研究论文。团队针对布鲁氏菌病防控中“难以区分疫苗免疫与野毒感染”的核心痛点，基于新羿数字PCR（dPCR）平台，建立了靶向VirB8和缺失VirB12基因的双重检测体系，为布鲁氏菌A19-ΔVirB12疫苗株的精准识别及野毒感染诊断提供了高灵敏、高特异的技术工具，助力人畜共患病科学防控。

研究背景

布鲁氏菌病是全球流行的人畜共患病，可致家畜流产、人类慢性症状（如波浪热、肌肉关节痛），全球年报告病例超50万，实际病例因诊断监测不足更甚。中国以疫苗免疫为核心防控策略，其中布鲁氏菌A19-ΔVirB12基因缺失疫苗应用广泛，其保护力接近亲本株且毒力更低，还携带诊断标记，2021年正式推出。

但传统检测存在关键局限：血清学检测无法区分疫苗免疫与野毒感染诱导的抗体，常规荧光定量PCR（qPCR）灵敏度不足，缺乏能有效区分两者的高灵敏核酸检测方法。数字PCR（dPCR）作为第三代核酸定量技术，具有更高灵敏度、绝对定量能力及抗干扰性强等优势，为解决上述痛点提供了技术可能，故开展本研究以建立针对该疫苗株的检测方法。

研究目的

建立双重dPCR检测体系，实现“精准区分+高敏检测”：

• 设计靶向布鲁氏菌属保守基因VirB8（用于属水平鉴定）和A19-ΔVirB12疫苗株缺失基因VirB12（用于疫苗株区分）的引物与探针；

• 优化双重dPCR的反应条件（引物浓度、探针浓度、退火温度）；

• 验证该方法的灵敏度、特异性及临床适用性，最终实现“同时检测布鲁氏菌+区分疫苗株与野毒株”的双重目标。

  
  

研究方法

本研究纳入2023-2024年山东省烟台、临沂、青岛等7市有流产症状牛群的53份临床样本（含牛奶、阴道拭子），同时使用布鲁氏菌A19-ΔVirB12疫苗株，及山东省动物疫病预防与控制中心保存的牛分枝杆菌、大肠杆菌（O:157）、沙门氏菌、链球菌、炭疽杆菌等菌株核酸；用建立的dPCR体系与商用荧光定量试剂平行检测53份临床样本以验证临床适用性。

研究结果

※ 反应条件优化结果

最优30μL dPCR体系为：15μL dPCR SuperMix（2×）、1μL DNA模板、1.8μL VirB8/VirB12引物（10μmol/L）、0.9μL VirB8/VirB12探针（10μmol/L），无菌水补至体积；扩增程序：95℃预变性10分钟→40个循环（94℃变性30秒+54℃退火1分钟）→12℃冷却5分钟。此条件下，荧光信号集中，阳性/阴性微滴无交叉，无“拖尾”现象，微滴数量与扩增效率均达最优。

图1 

※ 灵敏度：可检出单拷贝核酸

• VirB8：在2.13×10⁴-2.13×10⁰copies/μL范围内稳定检出，最低检出限为2.13×10⁰copies/μL（即单拷贝）；

• VirB12：在2.26×10⁴-2.26×10⁰copies/μL范围内稳定检出，最低检出限为2.26×10⁰copies/μL；

• 线性关系：两者标准曲线R²分别为0.9991（VirB8）和0.9999（VirB12），实测拷贝数与理论值高度一致，定量准确性优异。

图2 

※ 特异性：仅识别目标菌株

对牛分枝杆菌、大肠杆菌O:157等7种非布鲁氏菌的DNA检测均为阴性，仅A19-ΔVirB12疫苗株能扩增出VirB8阳性信号（VirB12因缺失未扩增），证明引物探针特异性100%。

图3 

※ 临床样本检测：阳性率更高，可区分疫苗株

阳性率对比：dPCR检出45份阳性样本，阳性率84.91%；商用qPCR仅检出32份阳性，阳性率60.38%，dPCR灵敏度显著更高；

• 疫苗株识别：在聊城、日照、东营的免疫牛群样本中，dPCR检出2份A19-ΔVirB12疫苗株阳性（VirB8+、VirB12-），而qPCR无法区分；

• 流行趋势提示：烟台、青岛、威海等未免疫牛群中仍检出野毒感染，提示山东沿海地区需加强布病防控。

总结与讨论

综上，本研究建立的双重dPCR检测方法具有优异的特异性与灵敏度，可精准鉴定样本中的布鲁氏菌，同时有效区分野毒感染株与A19-ΔVirB12疫苗免疫株，为布鲁氏菌病防控提供了宝贵的技术支持。同时，临床样本分析显示，山东青岛、烟台、威海等沿海城市存在布鲁氏菌感染，需加强这些地区的布鲁氏菌病防控工作。

原文链接：

https://doi.org/10.3389/fmicb.2025.1684156

●关于新羿生物●

新羿生物成立于2015年，位于中关村科技园，是国家高新技术企业、北京市“专精特新”企业，专注于生命科学与分子诊断的自主创新，拥有在仪器、芯片、材料、试剂、软件等领域的高水平研发团队。公司发展迅速，申请国内外专利200余项、授权专利150余项，持续在权威期刊发表学术论文，承担国家级科研基金。公司基于自主知识产权的数字PCR技术，已获得首个及第二个共三项数字PCR仪NMPA III类医疗器械注册证，三项诊断试剂NMPA III类医疗器械注册证，其中感染和实体瘤液体活检领域均为首个数字PCR诊断试剂III类注册证，两次获得中国体外诊断优秀创新产品金奖，荣获中关村国际前沿科技创新大赛总冠军，荣获北京市科学技术二等奖和发明创业成果奖。公司自主研发的开放式分子POCT一体机及qPCR快检试剂均获NMPA III类医疗器械注册证。公司秉承“创新，让精准触手可及”的理念，发展多指标、高通量、自动化、防污染、成本低的先进技术，致力于成为领先的生命科学和分子诊断企业，服务于生命科学、精准医疗、药物开发及健康管理。