HIV-1耐药检测新策略：新羿数字PCR扩增联合NGS实现1%低频突变精准检出

HIV疗失败的核心挑战在于耐药突变（DRMs）的早期监测。传统Sanger测序对低频突变（<20%）检测灵敏度不足，而二代测序（NGS）虽可检测低频变异(1-5%)，但由于普通PCR（bulk PCR）扩增步骤，在扩增过程中可能引入偏好性偏差导致低频突变比例被低估。北京地坛医院团队通过创新性应用数字PCR扩增（新羿数字PCR平台）联合NGS测序，将低频耐药突变的检测灵敏度提升至1%以下，且通过单分子扩增有效降低了普通PCR的扩增偏好性，为临床提供了更精准的耐药监测方案。

研究方法

2023-2024年北京地坛医院106例ART治疗失败的HIV感染者（病毒载量≥50 copies/mL），按病毒载量分层（<1000、1000-9999、>10000 copies/mL）。

※ 技术对比

- 新羿dPCR vs 普通PCR：同步扩增HIV-1 pol基因（PR/RT/IN区），比较扩增效率；后续进行Sanger测序和NGS测序，分析低频突变检出差异。

- 关键改进：dPCR通过微滴分割（单分子扩增）减少扩增偏差，提升低频突变富集能力。

关键结果

※ 技术性能

- 扩增成功率：dPCR整体达97.2%（PR/RT区）和93.4%（IN区），与普通PCR无显著差异（P>0.05）。

- 一致性验证：99%（102/103）样本的两种方法扩增序列聚类一致，证实dPCR结果可靠性。

※ 耐药突变检出

- Sanger测序：50.5%（52/103）样本检出耐药突变，NNRTIs耐药率最高（37.9%，如K103N、V106M）。

- NGS低频突变：普通PCR扩增联合NGS仅检出31个突变，dPCR扩增联合NGS检出39个突变（+25.8%），包括与当前治疗相关的Y181C、M184V等关键位点。

临床意义

治疗失败预警：低频突变≥1%时，NNRTIs方案失败风险增加（5例继续使用TDF+3TC+EFV均失败）；≥2%突变可能发展为优势毒株如患者1684的M184V突变在病毒反弹时被确认）。。

方案优化：检出低频NRTIs突变（如K65R）后，换用INSTIs/PIs方案（如DTG+3TC）可提高治疗成功率（9/15例病毒抑制）。

临床启示

※ 检测策略

对治疗失败患者，推荐dPCR扩增联合NGS，以捕获低频耐药突变。

※ 临床应用价值

- 优化治疗方案：dPCR扩增与NGS联合检测可发现sanger测序遗漏的低频耐药突变，指导临床优先选择耐药屏障更多的药物（如INSTIs）或增效PI方案，提升治疗成功率。

- 精准耐药监测：对治疗失败患者（尤其是病毒载量较低或怀疑存在低频突变的病例）常规进行dPCR扩增与NGS联合检测，进行精准的耐药监测。

总结与讨论

※ dPCR独立检测HIV-1耐药的优势

- 超高灵敏度，精准捕获低频突变：通过微滴单分子扩增技术，消除引物竞争偏倚，可检测<1%的低频耐药突变。

- 低病毒载量样本仍保持优异性能：基于微滴分区扩增技术，有效降低优势模板竞争，确保稀有耐药突变信号不被淹没。对低病毒载量样本仍保持优异性能。

- 绝对定量，结果更可靠：无需标准曲线，直接输出耐药突变绝对比例，助力临床决策。

※ dPCR独立检测的可行性

- 多重检测能力：单管反应可同步检测HIV-1核心耐药位点（如K65R、M184V、K103N等），实现高效全面的耐药分析。

- 无需NGS辅助：超高灵敏度结合特异性探针，直接对关键位点定量，省去复杂测序流程。

- 快速经济：3小时内完成检测，成本远低于NGS，更适合临床常规开展。

 未来已来：dPCR引领HIV-1耐药检测新标准

数字PCR不仅是扩增技术的突破，更具备全流程解决方案的潜力。随着耐药Panel的优化，dPCR有望成为HIV-1耐药筛查的首选方案，让精准医疗更高效、更可及！

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